Laboratoř vývojové genetiky
Naše laboratoř disponuje ojedinělou kombinací několika modelových organismů, konkrétně mouchy Drosophila melanogaster, brouka Tribolium castaneum a červa Caenorhabditis elegans, s molekulárními technikami v buněčných kulturách a in vitro. Výhody reversně genetických přístupů (transgenese, mutagenese, RNAi), u těchto modelů využíváme ke studiu biologických otázek v kontextu živého organismu během jeho vývoje. Biologické procesy našeho zájmu zahrnují:
- Hormonální a genetická regulace vývoje, metamorfosy a oogenese hmyzu
- Role jaderných receptorů a transkripčních faktorů
- Molekulární mechanismus působení Juvenilního hormonu
- Vývojová genetika buněčné diferenciace a asymetrického buněčného dělení
Řešené výzkumné projekty
Receptor juvenilního hormonu
Juvenilní hormon (JH) je terpenoid, malá lipofilní molekula zásadního významu pro vývoj a rozmnožování hmyzu. JH byl pojmenován podle schopnosti blokovat metamorfózu larev v dospělce: teprve když larvy dorostou potřebného stupně vývoje, zástava tvorby JH metamorfózu dovolí. Larvy ošetřené JH nedospívají, a tudíž látky s aktivitou JH slouží jako účinné insekticidy. Molekulární podstata působení JH zůstávala dlouhá desetiletí záhadou, jelikož se nedařilo nalézt receptor tohoto hormonu. V r. 1986 izoloval T.G. Wilson mutantní kmen mouchy Drosophila, nazvaný Methoprene-tolerant (Met) podle odolnosti vůči insekticidu na bázi JH. Gen Met kóduje transkripční faktor rodiny bHLH-PAS, do níž patří receptor toxické zplodiny dioxinu, ale žádný z receptorů známých hormonů. V roce 2007 přinesla naše laboratoř průlomový důkaz, že JH inhibuje metamorfózu brouka Tribolium právě prostřednictvím genu Met, jehož ztráta má na larvy stejný dopad jako ztráta JH – předčasnou metamorfózu. V práci uveřejněné na konci roku 2011 časopisem PNAS jsme přinesli nezvratné důkazy pro receptorovou funkci proteinu Met. Vytvořili jsme počítačový model struktury JH-vazebné domény Met a podle něj připravili sadu bodových mutací tak, abychom JH stericky vytěsnili. Testováním mutantních verzí proteinu Met in vitro jsme prokázali účast specifických aminokyselin na vysoko-afinitní vazbě k JH. Pomocí mutant neschopných vázat JH jsme dokázali, že nedávno popsané interakce Met s partnerskými proteiny závisí na schopnosti Met vázat JH nebo metopren. Met tedy funguje podobně jako některé jaderné receptory, např. kyseliny retinové nebo hormonu štítné žlázy, avšak patří do zcela jiné rodiny proteinů a je tudíž prototypem hormonálního receptoru nové třídy. Naše výsledky řeší dlouho nezodpovězenou otázku mechanismu působení juvenilního hormonu a jeho insekticidních analogů.
Interakce mezi bZIP proteiny Jun a Atf3 v epiteliální morfogenesi během metamorfosy
Pohyby, fúze a uzavírání epiteliálních tkání jsou zásadní pro vývoj živočichů, např. během embryogeneze, ale také při hojení jizev. Moucha octomilka, Drosophila melanogaster, poskytuje několik modelových příkladů takových epiteliálních pohybů a fúzí. Zajímavým případem je formování zadečku (abdomenu) dospělé mouchy. Během metamorfózy muší larvy v dospělce zanikají velké larvální epidermální buňky (LEC). Ty musí epitel opustit a vytvořit tak místo pro nové buňky (histoblasty), které se rychle dělí a migrují, dokud neobsadí celý povrch abdomenu; poté vytvoří kutikulu dospělce. Regulace této složité výměny buněčných populací není jasná. Vědělo se, že celý proces, stejně jako metamorfózu ostatních tkání, stimuluje steroidní hormon ekdyson, a že odstranění LEC vyžaduje změny cytoskeletu závislé na signální dráze Rho. Překvapivě jsme zjistili, že protein Atf3, transkripční faktor z rodiny bZIP, hraje v metamorfóze abdomenu roli. Aktivita genu atf3 musí být během výměny buněčných populací potlačena, jinak Atf3 zablokuje odstranění LEC z epitelu tím, že interferuje se signalizací Rho a zvyšuje tak soudržnost LEC. Tyto staré larvální buňky pak brání uzavření epitelu dospělce. K tomuto účinku Atf3 nutně vyžaduje svého vazebného partnera, známý onkoprotein Jun. Ačkoli interakce těchto dvou důležitých regulačních proteinůbyla dobře známa ze studií na buněčných liniích, naše výsledky poprvé prokázaly vývojovou funkci komplexu Atf3-Jun in vivo.
Juvenilní hormon: mechanismus působení během metamorfosy hmyzu
Proměna neboli metamorfosa hmyzu, jako jsou např. brouci nebo motýli, je nápadnou změnou mezi juvenilními stadii (larvou, kuklou) a dospělcem. Tato proměna usnadňuje larvám účinně využít zdroje potravy a létajícím dospělcům pak šířit potomstvo. Spuštění metamorfosy závisí na steroidních hormonech, ekdysteroidech, které přeměnu larev na kukly a dospělce stimulují, a na protichůdně působícím juvenilním hormonu (JH), jenž oddaluje metamorfosu až do doby, kdy larva dosáhne potřebné velikosti a stupně vývoje. Že JH brání metamorfose ukázal již V.B. Wigglesworth, avšak mechanismus přenosu signálu JH do buněk ani molekulu receptoru JH se ani po více než 70 letech výzkumu nepodařilo odhalit. Na modelu brouka Tribolium castaneum jsme ukázali, že JH blokuje metamorfosu prostřednictvím genu Met (Methoprene-tolerant), který byl původně objeven díky resistenci k JH u mouchy Drosophila. Potlačení funkce Met u brouka nejen navodí necitlivost vůči JH, ale na rozdíl od drosofily také předčasný vstup larev do metamorfosy. Jak jsme dále zjistili, Met řídí průběh metamorfosy tak, že v odpověď na JH reguluje geny Broad-Complex a Krüppel-homolog 1 (Kr-h1), které v řízení hmyzí larvy v kuklu a v dospělce hrají klíčovou úlohu. Naše práce tak poprvé identifikovaly geny zprostředkující vliv JH na řízení hmyzí metamorfosy a přinesly důkaz pro možnou funkci proteinu Met jako receptoru JH. Platnost modelu signalizace JH jsme oveřili u evolučně vzdálených druhů hemimetabolního hmyzu.
